【評(píng)價(jià)原理】
化合物直接作用于角膜引起的刺激作用類似于細(xì)胞毒性損傷作用，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞毒性指標(biāo)，可反映角膜損傷的程度。試驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的兔角膜上皮細(xì)胞（SIRC），短時(shí)暴露于供試品，模擬急性角膜刺激作用，通過(guò)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率來(lái)預(yù)測(cè)供試品引起的眼睛損傷。
【實(shí)驗(yàn)方案】
取穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/mL，按每孔200μL細(xì)胞懸液接種于96孔板（6000個(gè)細(xì)胞/孔）中（除最外周孔）。設(shè)置空白對(duì)照、培養(yǎng)基對(duì)照、溶劑對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照組和供試品組。放人二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)條件培養(yǎng)48h。換液，去除完全培養(yǎng)基，PBS清2次，加新鮮完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h。待上述培養(yǎng)的細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí)暴露于200μL5%和0.05%供試品溶液中，染毒5min，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將做相應(yīng)的處理。染毒結(jié)束，用200μL磷酸鹽緩沖液沖洗2次。
然后每孔中加入200μLMTT（0.5mg/mL）溶液，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，倒出MTT溶液，加入200μL0.04N酸化異丙醇作用60min提取MTT甲瓚（室溫暗室中操作），然后在多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定570nm處吸光度值(OD570值)。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活率。
每個(gè)樣品需重復(fù)三次試驗(yàn)。當(dāng)5%和0.05%濃度的受試物的細(xì)胞存活率均大于70%時(shí)，則判斷該受試物眼刺激強(qiáng)度為無(wú)刺激性或微刺激性；當(dāng)5%和0.05%濃度的受試物的細(xì)胞存活率均≤70%時(shí)，則判斷該受試物眼刺激強(qiáng)度為腐蝕性(不可逆眼損傷)；若受試物0.05%濃度溶液的細(xì)胞存活率大于70%，而5%濃度溶液的細(xì)胞存活率≤70%時(shí)，則需加做其他試驗(yàn)加以判定。
【評(píng)價(jià)指標(biāo)】
細(xì)胞存活率
【結(jié)果展示】
1、供試品刺激反應(yīng)分級(jí)表
【評(píng)價(jià)結(jié)論】
1、供試品1在5%和0.05%濃度的細(xì)胞存活率均≤70%時(shí)，則判斷該受試物眼刺激強(qiáng)度為腐蝕性(不可逆眼損傷)；供試品2在5%和0.05%濃度的細(xì)胞存活率均大于70%時(shí)，則判斷該供試品眼刺激強(qiáng)度為無(wú)刺激性或微刺激性。
參考文獻(xiàn)：
[1] 化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)Short Time Exposure In Vitro Test Method (STE)
浙公網(wǎng)安備 33010802003447號(hào)